免疫檢查點阻斷、個性化腫瘤疫苗和溶瘤病毒療法等免疫療法的出現是抗腫瘤治療史上的一個里程碑。不幸的是，免疫治療只對有限的癌癥類型有效，患者很可能在短時間內產生耐藥性。最近的研究表明，在大多數實體癌中，高的腫瘤突變負荷不能作為預測ICB應答的精確生物標志物。因此，需要免疫治療結果的預測性生物標志物。然而，對于免疫治療如何改變免疫微環境，以及它如何通過腫瘤非腫瘤細胞相互作用發揮作用，我們知之甚少。腫瘤浸潤性淋巴細胞的重要組成部分，影響預后和臨床特征，在腫瘤免疫治療中發揮基礎性作用。因此，對TILs進行全面、動態的監測有助于進一步探索腫瘤免疫治療的邊界。
測序技術為細胞生物學、疾病病原學和藥物反應提供了新的見解。批量測序研究以整個腫瘤為靶點，分析腫瘤內細胞的平均基因表達。然而，反映TME潛在異質性和可塑性的特定功能亞群可能被忽視。腫瘤主要由腫瘤細胞、間質細胞和免疫細胞組成，這些細胞可分為不同的亞型。這些細胞構成了腫瘤異質性，在腫瘤進展中起主要作用。scRNAseq的存在可以通過分析和量化單個細胞的整個轉錄組來探索腫瘤異質性。對于單個細胞，其遺傳學和表觀遺傳學被揭示來預測其在癌癥中的作用和對治療的反應。此外，基于單個細胞的空間轉錄揭示了單個細胞在原始腫瘤中的空間位置和細胞間通訊的局部網絡。
最近，許多癌癥類型的免疫環境，如黑色素瘤，乳腺癌，肝癌，非小細胞肺癌，已經被scRNAseq揭示，其中T細胞，B細胞，骨髓源性抑制細胞，樹突狀細胞，它們分泌的細胞因子/趨化因子構成了一個復雜的相互作用網絡。令人印象深刻的是，T細胞一直是研究抗腫瘤功能的主要焦點，包括naveT細胞、效應記憶T細胞、衰竭T細胞、調節性T細胞和居住記憶T細胞，這些在幾種癌癥中都有描述。B細胞作為體液免疫的主要效應體，在TME成分和免疫治療反應中也有顯著作用。大量RNA測序顯示，B細胞相關標記物在免疫治療應答者和非應答者之間表達差異最大。B細胞以三種方式攻擊癌癥:1.分泌免疫球蛋白介導抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬作用和補體依賴性細胞毒性;2.抗原提呈激活T細胞;3.分泌GranzmeB、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體和IFNγ直接殺傷腫瘤細胞。因此，腫瘤浸潤B細胞可能對腫瘤預后有重要意義，并可作為預測免疫治療的生物標志物。然而，專注于B細胞的研究比專注于T細胞的研究要少得多，這使得它們在癌癥免疫治療中的復雜機制不清楚。隨著scRNAseq技術的發展，TILBs的位置和功能可以被精確地確定，這可能有助于更好地理解其機制。從單細胞的角度來看，在本文中，我們討論TILBs亞種群分化軌跡，與其他細胞的相互作用，并總結B細胞的機制調節時間和影響免疫治療效果，旨在為腫瘤研究提供一種新的方式針對B細胞。
單細胞測序可以進一步探索腫瘤內的異質性。與流式細胞術、質譜法或其他任何以前的方法不同，單細胞測序是一種連續的方法，而不是離散的方法。scRNAseq的步驟主要包括以下四個步驟:單細胞分離，反轉錄成cDNA，A，測序庫構建。熒光激活細胞分選可用于從組織中分離特定的細胞。在B細胞研究方面，采用流式細胞術篩選CD45細胞，增加B細胞的比例；也可根據B細胞標記物直接選擇靶向B細胞。作為scRNAseq技術的突破，微流控系統將單個細胞封裝在獨立的微液滴中，該微液滴包含一個獨特的分子標識符，用于對單細胞內的微轉錄材料進行條形碼。根據每個細胞的UMI，即使細胞被裂解，在后續的分析中也可以找到轉錄信息。基于這一特點，10×Genomiium平臺同時測序數千個細胞。與Smartseq2等低通量方法相比，10×Genomiium平臺因其成本低、效率高而被更廣泛地應用于B細胞檢測。
在對多種scRNAseq方法的比較研究中，10×Genomics也比其他高通量方法如Drodrops具有更高的靈敏度，更高的與線粒體基因匹配的reads比例，更低的噪聲。利用10×Genartseq2平臺，可以通過不同的免疫球蛋白重鏈特征區分CRC中B細胞的亞群，聚類結果無明顯差異。但是，10×Genomics也有不足之處，它不能覆蓋所有的基因，并且存在3‘區域偏倚，在檢測基因突變或mRNA剪接位點時可能會遺漏一些重要信息。此外，這種方法對細胞質量有更高的要求，不同的組織和不同的獲取樣本的方法都不同。利用scRNAseq，我們可以更精確地定義細胞的亞型，追蹤它們的發育譜系，確定克隆型和表現型之間的關系，繪制不同細胞之間的相互作用和空間關系圖，從而從多個維度描述TME。此外，還需要通過一系列體內和體外實驗來驗證結果。我們總結了使用scRNAseq研究的最新出版物 B細胞受體是一種能識別并結合特異性抗原的膜免疫球蛋白，在B細胞的分化成熟過程中起著重要作用。BCR由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中可變、多樣性和連接基因序列的重組創造了B細胞的多樣性。這種多基因的復雜性使得鑒別不同的受體變得困難。然而，由于每個B細胞通常表達一個單一的受體，潛在的抗原特異性受體可以通過給定的原細胞鏈發現。BCR的兩個主要功能如下。首先，它通過誘導B細胞激活過程中肌動蛋白骨架的實質改變和各種基因的表達來激活B細胞。其次，它介導抗原的鑒定和提取，從而導致加工過的肽在主要組織相容性復合體II上呈現給T輔助細胞。因此，BCR測序有助于進一步了解B細胞分化的軌跡及其特異性識別抗原性的機制，特別是當與單個B細胞的完整轉錄組身份配對時，這為了解癌癥的發展提供了線索。更重要的是，BCR測序可以追蹤來自單細胞的群體，揭示克隆型和表型之間的關系。ScRNAseq技術在BCR測序中具有天然優勢，因為含有UMI的微流控系統可以保證同源VHVL配對的保存，而這些同源VHVL配對在B細胞批量測序中可能會丟失。BASIC是一個在單細胞分辨率上進行BCR測序的平臺。作為重建配對全長BCR序列的工具，BraCeR為B細胞的克隆推斷和譜系追蹤提供了一個完整的管道。LIBRAseq是一種高通量的方法，將BCRse序列與其同源抗原特異性連接起來，可以用來繪制特定對象中數千個B細胞的抗原特異性。
研究免疫球蛋白以探討體液免疫的復雜性 免疫球蛋白存在于腫瘤和血清中，在腫瘤中起雙重作用。抗體通過其片段可結晶支配功能，并受翻譯后修飾調控。通常，免疫球蛋白是由骨髓和脾臟的漿細胞分泌的。組織炎癥區域和腫瘤內部的pc，特別是在三級淋巴結構中，分泌腫瘤相關抗體并直接在腫瘤上誘導原位效應。在抗腫瘤功能方面，IgG是最重要的一類人免疫球蛋白，因為它能夠結合巨噬細胞和自然殺傷細胞上的Fcγ受體，并促進ADCC、ADCP和CDC的作用。此外，IgG對抗原處理和呈遞至關重要，因為抗原呈遞細胞上的Fcγ受體可以與IgG包被的免疫復合物結合，激活T細胞。抗體和抗體分泌細胞的單細胞測序有助于進一步明確B細胞體液免疫的復雜網絡。已經報道了一種單細胞液滴微流控測序方案，用于特異性結合靶細胞的抗體，這也適用于初級人類liGO是一種液滴微流體系統，用于高通量單細胞篩選分泌IgG的原代細胞，一方面，通過基于熒光的液滴內單細胞生物測定檢測IgG活性，另一方面，用barcoded反轉錄對配對的V基因進行測序。
外周血未成熟B細胞通過高內皮靜脈進入B淋巴濾泡。在B細胞濾泡中，naveB細胞通過固有apc)接觸抗原，之后激活BCR信號誘導抗原提取、內化和加工，將肽呈現在MHCII上。然后，B細胞遷移到與T細胞相鄰的濾泡區邊緣，將抗原呈遞給濾泡輔助T細胞。因此，Tfh細胞刺激BCR，誘導naveB細胞分化，主要包括記憶B細胞、短命B細胞和生發中心B細胞。這些不BCs表達RGS13，可能增加GC抗性。此外，它們缺乏B細胞進入和離開GCs的CCR7和GPR183。為了分化為GCB細胞，它們首先進入GC的暗區，在那里它們的膜表面免疫球蛋白通過體細胞高突變發生變化，稱為親和成熟。接下來，它們在亮區經歷一個競爭過程，在那里許多B細胞聚集，它們的命運取決于它們與Tfh細胞的相互作用，可能有能力捕獲和呈現抗原，并發生類轉換重組。這個過程也依賴于Tfh細胞分化的結果，導致B細胞的結果。低親和性B細胞成為長壽命MBCs，高親和性B細胞成為PCs，其他細胞凋亡或重新進入Z進行SHM和克隆擴增。最近的研究cLZB細胞亞群包括親和力較高的PC前體或未來的DZ進入者，以及一些親和力較低的MBC前體。值得注意的是，BCR在這個過程中起主要作用，B細胞分化的體液免疫過程中兩個重要的檢查點是naveB細胞和GCB細胞上的抗原提呈，這可能會提高體液免疫應答。此外，在單細胞水平上的完整轉錄組字符化將特別有助于確定naveB細胞向PC分化過程中的轉錄軌跡和異質性。
B細胞分布不均一 以往對B細胞的研究主要基于免疫組化或流式細胞術，限制了B細胞的清晰分類。Wouters等人回顧了69項研究，研究tilb在19種癌癥中的預后意義，以探索B細胞對抗腫瘤免疫貢獻的不確定性，其中B系細胞的預后意義不同。有研究發現B細胞激活髓樣細胞上的FcRγ受體，促進鱗狀細胞的癌變。然而，帶有抗cd20抗體的B細胞耗竭促進小鼠中黑色素瘤的發生。到目前為止，B細胞在腫瘤中的功能尚不清楚。這主要是由于在不同的組織中存在不同的B細胞亞群，在分類、功能和空間上。scRNAseq的應用提供了高分辨率，可以揭示不同組織間分布的不確定性和不均勻性，從而揭示免疫原性或免疫抑制性TME。通常，B細胞只占正常人體器官細胞組成的一小部分。例如，B細胞在正常胰腺組織中是有限的，但在胰腺癌中約占5。在原發肺腫瘤中，B細胞也比正常肺組織增加。此外，正常肺組織中浸潤的多為分泌GranzmeB的細胞毒B細胞，而在原發性肺腫瘤和淋巴結轉移中，由于腫瘤抗原的克隆擴增和生成，不同bcr的GCB細胞增多。同樣，與正常乳腺組織相比，原發性乳腺癌中TILBs密度增加。此外，在乳腺癌中，TILBs比B細胞在次級淋巴組織中表達更多的Th1效應細胞因子，提示1型細胞免疫應答。在一個三陰性乳腺癌隊列中，scRNAseq證據顯示，TME中的B細胞具有更多的SBCs特征，而aveB細胞。這可能是因為原發性腫瘤發生時，外周血中大量naveB細胞受到高質量腫瘤新抗原的刺激，在GCs中發生SHM，從而遷移到TME或TLS。然而，通過scRNAseq分析，與癌旁組織和癌前組織相比，人類CRC組織的增殖狀態更高，分散程度更高，MHCII類基因評分更低，抗原呈遞能力更低，提示CRC存在不同的免疫抑制TME。
